DNA残留分析方法验证（CHO细胞DNA残留检测）

づ落葉ぴ無痕 · 发表于 2017-4-24 10:57:34

采用qPCR法检测CHO细胞残留DNA，样品物质2fg，1pg/mg。标准是100pg/mg
分析方法验证，线性和范围，以及定量限怎么做，求前辈指点下！
需要用对照品么，到哪里买？（CHO细胞DNA残留检测）

桑园 · 发表于 2017-4-24 12:03:20

线性、范围、定量限《药典》通则有，至于对照品，肯定是从宿主细胞中提取的，提取之后再用试剂盒标定。提取用的试剂盒可以很容易的买到，很多做分子的试剂公司都有，或者你查文献自己配制提取试剂也可以。标定对照品的试剂盒也可以从试剂公司买到。
注意验证范围应该涵盖你生物制品实际的外源DNA含量。

lz20112012 · 发表于 2017-4-24 12:29:32

药典四部，再参考一下三部的要求

づ落葉ぴ無痕 · 发表于 2017-4-24 12:31:42

桑园发表于 2017-4-24 12:03
线性、范围、定量限《药典》通则有，至于对照品，肯定是从宿主细胞中提取的，提取之后再用试剂盒标定。提取 ...

对照品不可以买现成的吗，有没有直接可以用的

线性范围，尤其是这种残留的定量没做过，不知道具体该怎么做，能否指导下

yuanyanxi123 · 发表于 2017-4-24 12:32:18

CHO罗氏和life都有试剂盒！试剂盒里面有标准品！中检所也有大肠杆菌的，没打听过有没有CHO的！线性和范围一般都是在中间精密或者重复性的数据，分析一下是不是在规定单位内，如R2，定量限度一般是标准曲线最低点，满族RSD和回收要求即可，一般都在3pg/ml，这种一般都选试剂盒，标准品和引物如果自己制备很难解释您的覆盖问题

づ落葉ぴ無痕 · 发表于 2017-4-24 12:38:22

yuanyanxi123 发表于 2017-4-24 12:32
CHO罗氏和life都有试剂盒！试剂盒里面有标准品！中检所也有大肠杆菌的，没打听过有没有CHO的！线性和范围一 ...

我采用的湖州的试剂盒，没找到CHO DNA的对照品，定量限3pg/ml需要做样品的3pg吗，还是只要通过标准品的标准曲线3pg/ml的数据即可。线性和范围一般都是在中间精密或者重复性的数据，具体是怎么用，直接用标准品数值吗，是否需要找样品稀释到标准曲线的各个点，可是样品DNA含量又不高

桑园 · 发表于 2017-4-24 15:11:23

づ落葉ぴ無痕发表于 2017-4-24 12:31
对照品不可以买现成的吗，有没有直接可以用的

线性范围，尤其是这种残留的定量没做过，不知道具体该怎 ...

DNA提取不是啥高难度活吧？我们是大肠杆菌，都是自己提取，自己用试剂盒标定。反正是通过显色深浅来比较的，可以设计低于、等于、高于几个标准，与样品一起抽滤上样，如果能证实方法可实现有效检测即可

yuanyanxi123 · 发表于 2017-4-24 23:13:02

づ落葉ぴ無痕发表于 2017-4-24 12:38
我采用的湖州的试剂盒，没找到CHO DNA的对照品，定量限3pg/ml需要做样品的3pg吗，还是只要通过标准品的标 ...

首先建议更换您的试剂盒！较差的试剂盒检测有一定的假阴性风险！第二个问题定量限度可以采用标准品加到样品中以回收来做，标准可以为回收率在70-130%.RSD20-30,中间还应该有一个寻找定量限度过程，就是稀释不同梯度的标准品溶液，如6/3/1.5/0.75！至于线性直接用标准品曲线数据进行线性分析，标准为r2大于0.99，范围也一样！对于这个实验来说DNA样品中含量很少，所以用液相含量的验证思路来弄生化验证是行不通的！

yuanyanxi123 · 发表于 2017-4-24 23:19:49

桑园发表于 2017-4-24 12:03
线性、范围、定量限《药典》通则有，至于对照品，肯定是从宿主细胞中提取的，提取之后再用试剂盒标定。提取 ...

样品中含量极低的情况也可以不用包含在单位内，报告低于定量限就行了！

桑园 · 发表于 2017-4-25 08:48:17

刚才查看了以下药典分析方法验证指导原则，限度的验证只需要做专属性、检测限、耐用性。这和《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》是一致的。

桑园 · 发表于 2017-4-25 08:50:52

yuanyanxi123 发表于 2017-4-24 23:13
首先建议更换您的试剂盒！较差的试剂盒检测有一定的假阴性风险！第二个问题定量限度可以采用标准品加到样 ...

这个方法是比较样品与定量DNA显色深浅，不需要绘制标准曲线

づ落葉ぴ無痕 · 发表于 2017-4-25 11:51:24

桑园发表于 2017-4-25 08:48
刚才查看了以下药典分析方法验证指导原则，限度的验证只需要做专属性、检测限、耐用性。这和《生物制品质量 ...

不对哦，这个虽然是限度试验，但是要按照杂志检查的定量来做的

yuanyanxi123 · 发表于 2017-4-25 12:18:05

桑园发表于 2017-4-25 08:50
这个方法是比较样品与定量DNA显色深浅，不需要绘制标准曲线

您说的是半定量DNA分子杂交法,咱们今天讨论的是PCR检测DNA

人勤春早 · 发表于 2018-10-31 12:27:53

搞不清楚校准曲线的下限和分析方法的定量限,怎么会是一回事呢?
日常分析用的校准曲线必须从定量限开始吗?可能从标准限度的10%开始,10%~120%,不代表方法的定量限就是10%啊，可能是1%呢

汪环 · 发表于 2020-6-3 11:48:38

请问还有人在做DNA残留吗？

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