一篇小文带您玩转显微观察方式

drtech185

显微镜作为实验室的常规设备，每天可见，其应用也非常广泛。小到微生物检测，大到产品的外观检查，覆盖了各个方面。可是，对于不同的显微观察方式，您真的了解吗？在这篇小文中，我们就简单扒一扒不同显微观察方式、优缺点及各自的应用范围。

1.明场BF

作为最常规的观察方式，明场的应用主要在于常规的镜检、组织、病理切片或者各类染色标本的观察。生物学专业的童鞋最熟悉的革兰氏阳性菌和阴性菌的观察，以及显微计数等，都离不开这种观察方式。

明场观察的优点是视野的亮度高、均匀；而且操作简单，成本不高。是非常受欢迎的一类观察方式。但同时也存在一些缺点，比如需要制片；物镜工作距离短无法观察较厚的样本等问题。另外，如果是透明标本，对比度较低，细节不易呈现。当然，这种观察方式也看不到样本的立体结构。

2.暗场DF

它的特点和明场不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场成为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的像。一般用于微小粒子、细菌形态、透明标本等的观察。能够观察到极其微小的物体，其分辨率可达0.4um，反差大。

这种观察方式不太多见，只能观察到物体存在、运动和外部形态等，对标本的要求也比较高。

3.相差观察PH

利用被检物体的光程差进行镜检，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。可用于活体细胞观察、无色透明活体标本的细微结构等。一般配置在倒置显微镜上，是鉴定活体细胞最实用、最经济的方法。可使细胞样本产生一些立体感。

但是，这种观察方式需要的光强较高，且切片不能太厚，需要控制在5~10um。操作有点麻烦，荧光效果不如明场物镜。在高倍下会产生光晕，影响成像效果。

4.偏光观察POL

偏光观察的原理是依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数，以此判别物质结构。这种观察方式成像一般非常漂亮。

但仅适用于具有双折射性的物质，比如矿物质、化学物品鉴别；鉴别纤维、染色体、淀粉粒、晶体；植物病理检验、骨骼、牙齿；胆固醇、神经纤维、以及毛发等。

5.微分干涉DIC

微分干涉原理是通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束在极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。这种观察方式最直接的效果就是产生立体感。可应用于观察无色透明活体标本的细微结构，立体感好、分辨率高

无色荧光标本，染色标本成像，以及用于显微操作等。

其缺点是需要的光强较高，双折射物质不能做DIC镜检。细胞培养客户最关心的细胞观察，需要使用底部为玻璃的器皿进行DIC观察。

6.浮雕相称IMC

IMC观察的原理比较简单，利用斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。这种观察方

经济实用，不限被观察样本的材质，可用于塑料皿的观察，调节也很方便。

可以用于胞质内精子注、IVF和细胞观察。

成像特点是图像显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕。可用于双折射物质的检测，也可用于检测玻璃、塑料等培养皿中的细胞，但分辨率不如DIC高。同时Leica专利的物镜可同时用于明场、暗场和荧光观察，使用方便。

7.荧光观察

什么是荧光呢？荧光就是物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。

显微镜下的荧光观察也是比较常用的观察方式。生物学中的荧光探针有三种类型：自发荧光、荧光染料以及荧光蛋白。其中自发荧光一般是天然的，无法控制，通常是令人讨厌的。荧光

染料明亮且光谱范围大，相对稳定，应用范围较宽，但是用于特异性标记细胞内蛋白时比较困难；荧光蛋白的优点包括通过融合目标蛋白可以在活细胞内表达；可以作为结构破坏的靶：

对一些环境参数敏感；缺点是波长选择有限，低光稳定性，光谱交叉，基团相对庞大等。

荧光探针通常被应用于定位、研究蛋白间相互作用、空间结构改变、细胞环境报道、基因表达报道等。对于细胞培养的客户，荧光通常用于染色区分活细胞和死细胞，细胞内成分染色

等。

*以上图片来自于Leica Microsystems。

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