动态显色法检测内毒素问题

A水杉

标准曲线很完美，平行样之间相关系数在2%以内,r值0.999,但同样的原料药检测，多次检测发现，有时回收率合格，有时不合格。不知道咋回事，都不敢检样了。国内用这个的也不多，怎么解决？求高手。

刘先聚

将冻干的Kinetic-QCL™试剂储存在2-8°C温度下。防止长时间受到光照。 复溶后的Kinetic-QCL™试剂应立即使用。复溶后的Kinetic-QCL™试剂可在2-8°C温度下保持稳定达8小时，或在-10°C或更低的温度下可保持长达两周时间。仅进行一次冻结和解冻。E.󰀃大肠杆菌󰀃O55:B5󰀃内毒素(E50-643)  红色标记的试剂瓶试剂瓶的复溶量参见检验证明书(CoA)中的说明，并且经过计算，可得到含有50 eu（或Iu）/ml的溶液。用规定量的LAL试剂检查用水进行复溶。在旋涡混合器上以高速剧烈漩涡混合至少15分钟。使用前，必须让储存的储备溶液温度上升到室温，并剧烈漩涡混合至少15分钟。这一点非常重要，因为内毒素容易附着在玻璃上。可登陆www.lonza.com/coa获取该检验证明书
冻干的大肠杆菌 o55:B5内毒素应储存在2–8°C的温度下。复溶后的内毒素储备液可在2–8°C的温度下保持稳定长达四周时间。
8 样品采集和制备 必须注意避免发生微生物或内毒素污染。与样品或检测试剂接触的所有材料必须无内毒素。将干净的玻璃器皿和材料在250°C温度下加热30分钟，使其无内毒素。应适当注意，防止无热原材料受到后续的环境污染。 根据经验，大多数经过消毒、独立包装的塑料移液管和移液管吸头都是没有内毒素的。但在常规检测使用前，应对这些材料进行检测。 可能需要使用无内毒素的氢氧化钠和盐酸，将样品的pH值调节到6.0-8.0之间。务必测定等分样品的pH值，以免被pH电极污染。请勿调节无缓冲的溶液。 待测样品必须储存在所有细菌活动受到抑制或内毒素水平不能随时间逐渐增加的条件下。例如，将样品在2-8°C的温度下储存不超过24小时，并冷冻超过24小时。最终用户有责任验证容器和储存条件是否适合其样品。
应采用重复样品，以便达到良好的技术水平和较低的变异系数。变异系数(C.v.)等于反应时间的“样品”标准偏差除以平均数，通常以百分比表示。重复样品反应时间的C.v.%应低于10%。根据经验，应可达到3~4%。

刘先聚

PH  
还有原料药本身特性

刘先聚

有时候不合适就是不合适

A水杉

刘先聚 发表于 2016-8-4 08:39
有时候不合适就是不合适

是方法不合适吗？

刘先聚

A水杉 发表于 2016-8-4 12:16
是方法不合适吗？

合不合适需要你在调整其他可能影响因素后再判断。

A水杉

刘先聚 发表于 2016-8-4 08:31
PH  
还有原料药本身特性

ph大概6点几左右，试剂都当天从冷库取。试剂取用应该没问题，因为标准曲线没问题。另外原料药加醋酸助溶了，有缓冲液存在条件下

刘先聚

A水杉 发表于 2016-8-5 08:46
ph大概6点几左右，试剂都当天从冷库取。试剂取用应该没问题，因为标准曲线没问题。另外原料药加醋酸助溶 ...

可能需要使用无内毒素的氢氧化钠和盐酸，将样品的pH值调节到6.0-8.0之间。谁知道呢……

刘先聚

2.    抑制/增强L AL反应以酶为媒介，因此，其拥有最佳的pH范围，以及特定的盐和二价阳离子要求。有时，试样可能将这些最佳条件改变到鲎试剂溶液对内毒素不灵敏的程度。样品
10 抑制LAL检测的阴性结果并不一定表示没有内毒素。         抑制/增强试验的目的是确定哪个级别的样品稀释能够克 服抑制或增强。每个样品稀释必须配一个阳性样品对照 (PPC)。winKQCL™ 软件自动计算出PPC中回收的内毒素含量，从而与已知的内毒素加标量进行比较。这样就能确 定哪些稀释不会产生影响。

刘先聚

http://wenku.baidu.com/link?url= ... GUJSW_93q-xjBoPyBLu

刘先聚

22 样品抑制 试样中的物质影响LAL反应时，会发生样品抑制。在Kinetic-QCL™试验中，该抑制导致反应时间变长，表明内毒素水平低于试样中可能存在的内毒素。应确定各个具体样品（未稀释或进行适当稀释）的样品抑制情况。 为了对样品抑制作用的缺失进行验证，将已知数量的内毒素加入等分的试样（或试样的稀释液）中。 建议内毒素加标使样本中的最终内毒素浓度等于0.5 eu/ml。对于可能含有背景内毒素水平 >1 eu/ml的样品，内毒素加标应使最终的内毒素浓度达到5.0 eu/ml。在抑制/增强试验中，对加标溶液(PPC)和未加标样品及其各自的内毒素浓度进行检测，并自动计算加标样本中回收的内毒素。回收的内毒素应等于加标已知浓度的50%到200%之内8。

A水杉

刘先聚 发表于 2016-8-5 08:57
2.    抑制/增强L AL反应以酶为媒介，因此，其拥有最佳的pH范围，以及特定的盐和二价阳离子要求。有时，试 ...

这个做过了，40,80,160,1000倍稀释，回收率影响不大，甚至稀释越大，回收率反而有所降低。方法学验证那会回收率在90%—110%,检样也没问题。现在检稳定性就不行了，结果不稳定。偶尔连回收率都没了，显示“check wells”

A水杉

刘先聚 发表于 2016-8-5 08:54
可能需要使用无内毒素的氢氧化钠和盐酸，将样品的pH值调节到6.0-8.0之间。谁知道呢……

强酸碱会破坏内毒素吧

刘先聚

A水杉 发表于 2016-8-5 10:56
这个做过了，40,80,160,1000倍稀释，回收率影响不大，甚至稀释越大，回收率反而有所降低。方法学验证那会 ...

那是否是试剂存储过久呢？

刘先聚

A水杉 发表于 2016-8-5 11:02
强酸碱会破坏内毒素吧

这是是用来调整PH的 内毒素还是很稳定的

刘先聚

刘先聚 发表于 2016-8-5 11:49
那是否是试剂存储过久呢？

你这个稀释是指 内毒素标样单纯稀释，还是稀释后再加入到原料中？

刘先聚

注：不建议使用塑料管稀释内毒素。内毒素容易附着在玻璃上。
使用前，必须让储存的储备溶液温度上升到室温，并剧烈漩涡混合至少15分钟。

刘先聚

我看这个实验真麻烦

A水杉

刘先聚 发表于 2016-8-5 12:06
我看这个实验真麻烦

太麻烦了，不知道咋回事，一不小心就出现这样那样的问题，设备灵敏度太高，会不会是设备不稳定？买到次品了