求教育！有关于液相色谱柱的知识

M_QQ

大家有没有关于液相色谱柱的分类、使用、注意事项等相关内容的培训材料？最近很想学习这方面的知识，谢谢各位~

清风化雨

高效液相色谱仪操作步骤：
1).过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2).对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3).打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪)，连接好流动相管道，连接检测系统。
4).进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5).有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。
6).调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7).设计走样方法。点击file，选取selectusersandmethods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换;d.走样时间，随不同的样品而不同。
8).进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9).关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10).填写登记本，由负责人签字。
注意事项：
1).流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2).柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
3).所有过柱子的液体均需严格的过滤。
4).压力不能太大，最好不要超过2000psi。
1、管路阻塞
阻塞是管路的主要故障,管路完全阻塞，压力会突然升高，超压。部分阻塞开始不明显，不断滞留在液流中的微粒压力会慢慢升高，最后完全阻塞。管路阻塞同时会看到接头或垫圈渗漏，低压好一些，高压渗漏明显。
管路完全或部分阻塞是由下列原因引起的：①没有很好过滤流动相；②样品中有微粒；③泵或进样器垫圈产生碎片；④预柱、护柱和分析柱中漏出填料；⑤毛刺和锉屑进入；⑥流动相中的结晶盐；⑦微生物⑧系统中进入了其它颗粒性物质。
系统中管路阻塞的现象很少见，常见的是烧结过滤片（玻璃砂芯）阻塞。用烧结过滤器或过滤片（孔径2-10um）能去掉阻塞管路的微粒（如0.25mm管径）。用系统分段法检查阻塞的管路，从后向前分别松开接头检查，找到阻塞管路后，应立即拆下来疏导或换新。
如果是非刚性物质阻塞，如生物样品中的生化物质（蛋白质）、微生物等，可用极细的金属丝导通，也可以在火头上烧一烧，使有机物炭化，而后再导通。
如果是刚性物质阻塞，要导通则十分困难，采用反冲的办法有时能成功。就是将管子调头用泵冲洗。操作时要注意保护眼睛和裸露的皮肤，因阻塞物会以很高的速度冲出来。无法导通的管路要换上同样规格的管子。如果换上新管后又被阻塞，则应该停机检查上面提到的引起阻塞的几种原因。
　　2、管头损坏
管子切口不平整或密封卡套不平滑都不能密封。要重新切割去坏管头（包括卡套），调换新卡套，装上接头挤压卡紧。大多数渗漏是由接头引起的，而不是管子问题。
3、接头故障的预防与解决办法几乎所有的接头故障都是可以避免的，按下列要求可以有效地预防接头的故障：
①使用仪器设计时的部件（如同一厂商的部件）；
②使用效果好的接头部件（如零死体积，即样品通过时V0=0）；
③按要求组装和拧紧接头，不可拧得过紧；
④避免接头混淆使用，及时作好标记；
⑤使用合格的工具。组装/拆卸接头时要检查在密封面上有无微粒和无机盐晶体。这些污染物影响密封性能，更严重的使螺丝咬死。最后，旋紧接头时最好用死扳手，保证不咬坏接头。平时要准备一些要能用到的各种接头备件。

清风化雨

高效液相色谱仪常见故障处理:故障1流动相内有气泡，关闭泵，打开泄压阀，打开purge键，清洗脱气，气泡不断从过滤器冒出，进入流动相，无论打开purge键几次，都无法清除不断产生的气泡。
原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。
处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可；亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时，轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，打开泄压阀，打开purge键，清洗脱气，如仍有气泡不断从过滤器冒出，继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，如没有气泡不断从过滤器中冒出，说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏，流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀，打开泵，流速调至1.0～3.0ml/min，纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀，纯甲醇冲洗半小时即可。
故障2柱压高原因(1)缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内；(2)样品污染沉积。
处理对于第一种情况先用40～50℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟；对于第二种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
故障3既无压力指示，又无液体流过[1>。
原因(1)泵密封垫圈磨损；(2)大量气泡进入泵体。
处理对于第一种情况，更换密封垫圈；对于第二种情况，在泵作用的同时，用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。
故障4压力波动大，流量不稳定.
原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。
处理工作中注意观察流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分脱气[2>。如为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗.
故障5出峰不佳，峰分叉。
原因(1)色谱柱被污染；(2)柱头填料塌陷。
处理对于第一种情况，先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平[2>。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。
故障6峰面积重复性不佳。
原因(1)进样阀漏液；(2)加样针不到位。
处理对于第一种情况更换进样阀垫圈；对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。日常工作中，液相色谱仪的保养非常重要，如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中，储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积；样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱柱的使用寿命，同时避免注射过浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞；色谱柱作好标记，用于不同分析.

xingqr

都是实际工作经验的总结，学习了，谢谢！

巴西木

M_QQ,你好，你可以看看下面的帖子。巴西木的主题里，关于气液相的主题有几个。

液相人员的好帮手--------HPLC色谱柱故障排除
https://www.ouryao.com/forum.php? ... 33&fromuid=4683