外源DNA残留，qPCR法检测，taqman探针，样品处理

hangzhouhdjy

大家好，请教一下。
市面上在售的的宿主DNA检测试剂盒，分为磁珠法的DNA前处理(提取)和taqman探针的DNA检测两部分，是可以单独购买的，而不是前处理和检测一起捆绑着出售。
是不是意味着某些样品可以不需要进行DNA前处理(提取)，直接对样品进行适当地稀释后上机检测？理论上说，样品不干扰检测，就能够忽略前处理的步骤。
如果可以的话，一般通过什么指标来判断呢？谢谢！

寒兰寒兰

要有前处理吧。一般都是分为2步，一步前处理提取DNA/RNA 一步PCR反应

jiafei4290

样本制备试剂盒和定量检测试剂盒可以单独购买和要不要DNA前处理（制备）是两回事（以ABI resDNASEQ试剂盒为例）：
1. 绝大部分样品是需要做前处理，去除干扰物质，如蛋白、去垢剂等，并且需要考察回收率。个别类型的样品也可以不用提取处理直接上样定量检测也可以，比如质粒样品的宿主DNA残留。
“是不是意味着某些样品可以不需要进行DNA前处理(提取)，直接对样品进行适当地稀释后上机检测？理论上说，样品不干扰检测，就能够忽略前处理的步骤”》》》》理论上如果样品不干扰检测，是可以直接检测的，但是实际操作中，怎么样评估和确定稀释倍数，怎么评估检测可信度。而且本来样品的残留DNA就不会太多，稀释后样品准确性不太好保证。
2. 可以单独购买是因为提取和定量试剂盒的使用比例不一样。定量需要做标曲，所以消耗会比提取快，因此，可能会有单独购买定量试剂盒的需求。有的实验，比如组织工程中法规有要求使用磁珠提取，检测使用picoGreen方法，因此又有单独购买提取试剂盒的需求。

hangzhouhdjy

jiafei4290 发表于 2020-10-3 09:39
样本制备试剂盒和定量检测试剂盒可以单独购买和要不要DNA前处理（制备）是两回事（以ABI resDNASEQ试剂盒为 ...

我看不少样本制备试剂盒以及定量检测试剂盒，各自里面的成分的量基本上匹配都是100个反应的。基本上定量检测试剂盒用完了，样本制备也差不多。我才以为两者单独出售，会意味着某些检测不需要对样本DNA进行纯化。
假如，样本的浓度为3mg/ml，用试剂盒自带的稀释液将样本稀释至1mg/ml，一份样本进行纯化后用50μl洗脱液重新定容，另一份样本不纯化直接取50μl样本待用。最后的结果是样本纯化与否都是未检出，样本加标纯化后和样本直接加标进行检测，各自回收率都合格，纯化与否的样本两者共用标曲，R2、扩增效率、精密度等都满足要求。
这种情况，能否初步判断样本不干扰检测，即忽略纯化过程，将样本适当稀释后，直接上机检测？谢谢

jiafei4290

hangzhouhdjy 发表于 2020-10-13 14:29
我看不少样本制备试剂盒以及定量检测试剂盒，各自里面的成分的量基本上匹配都是100个反应的。基本上定量 ...

至少你实验证明是没有干扰的。
其实也有文献报道有这样的检测方法，要么直接稀释了做qPCR，要么用pK酶消化下就可以做qPCR。这是最简单的方式，理论上也是可行的。
目前其实行业内说要做提取，目的其实还是尽可能纯化核酸，达到检测结果可靠，的确可能会导致实验麻烦点。

jiafei4290

hangzhouhdjy 发表于 2020-10-13 14:29
我看不少样本制备试剂盒以及定量检测试剂盒，各自里面的成分的量基本上匹配都是100个反应的。基本上定量 ...

另外，提取和检测试剂盒单独销售的目的主要是：
检测试剂盒要做标曲，消耗得快。提取试剂盒消耗得慢，基本上提取：检测=1:3。不单独卖这个有点说不过去