保和口服液沉淀的分析与去除及稳定性考察

沈阳长城过滤纸

蒲公英

花郎散落帝臣迷，灵运乾坤月印溪。

莫问匠心生本意，中华制药筑金堤。

一首原创七绝《蒲公英》送给所有的制药人，同时祝广州的蒲友早日战胜疫情！小编近期忙于出差和做实验，也是许久未更新口服液过滤工艺与澄明度研究成果，借六月的兰花香向大家汇报下近期工作情况。

中药口服液与颗粒剂是相对较为简单的产品，但是往往有很多潜在的问题容易被忽视，小编也是在走访过百余家口服液生产企业通过技术交流，现场发现较为普遍存在的问题与潜在风险，汇报前提出3个问题：

1、对于目前的过滤工艺：整体过滤设备+过滤耗材的搭配是否为最佳选择？

2、对于过滤材料的产品特点、潜在风险、产品参数的准确性评估及使用方法是否熟知？

3、对于口服液中的沉淀（较多）组成成分是否做过分析？

  过滤市场中过滤设备、过滤材料琳琅满目且良莠不齐，各有利弊，而我们的初衷是为口服液的过滤选择最佳过滤工艺以及优化现工艺，如果在过滤环节能够准确而高效的完成过滤任务，那么对于后期沉淀问题就可以先不考虑絮凝剂或者调解PH等，若是工艺本身问题，我们再另辟蹊径，寻找问题所在。关于耗材与设备的介绍在前几篇有过简短的分享，想了解更多可以拨打：王闯（小编本人）15702491096进行咨询。

下面为大家分享一篇“保和口服液”沉淀的分析与去除方式、成品的成分含量、稳定性的考察实验：

（一）蛋白质多糖含量测定

[size=12.0000pt]一、实验目的

1、利用苯酚-浓硫酸法测量口服液离心后上清液、沉淀液中多糖含量。

2、利用考马斯亮蓝法测定口服液离心后上清液、沉淀液中蛋白质含量。

3、熟悉在紫外分光光度计使用方法，在490nm(多糖)、595nm（蛋白质）处测量样品的吸收值。

二、实验方法

1、试剂：保和口服液、无水乙醇、85%磷酸、考马斯亮蓝G-250、浓硫酸、苯酚溶液、蒸馏水。

2、仪器：移液枪（100-1000μL），紫外分光光度计、离心机。

3、步骤：

（1） 用无水乙醇洗涤比色皿，使两个比色皿之间差距小于0.03。

（2）考马斯亮蓝G-290溶液配制：称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml,90%中，加入85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液可以在常温下放置1个月。

（3）供试品配制：将保和口服液均分于三个4ml的离心管中，放入转速为4000r/min的离心机中离心20分钟，取出离心管，立即实现沉淀与上清液分离，将上清液混合，摇匀，即得上清液供试品溶液。在盛有沉淀的离心管中各加1ml水，摇匀，将3个离心管中的沉淀液混合，摇匀，即得沉淀液供试品。将沉淀供试品溶液继续离心，重复以上操作3次，将最后一次的沉淀加入3ml水，摇匀，最后得到三份上清液供试品溶液，一份沉淀供试品溶液。

（4）蛋白质含量测定：量取1ml蒸馏水，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置三分钟，作为0号空白对照管。分别量取三份上清液供试品各1ml、沉淀溶液1ml,分别加入5ml考玛斯亮蓝，摇匀，静置三分钟，以0管为空白, 采用分光光度法在595 nm波长处测定吸收值,带入曲线中得出曲线对应蛋白质含量，带入公式蛋白质含量=曲线对应的蛋白质含量 (mg) ×稀释倍数/[当归溶液质量 (g) ×1 000]×100%求出蛋白质含量。

（5）多糖含量测定：吸取蒸馏水0.5ml，加入5%苯酚溶液0.5ml，加入浓硫酸2.5ml,, 摇匀, 室温放置15 min;30℃水浴放置15 min, 作为0号空白对照管。分别量取三份上清液供试品各0.5ml、沉淀溶液0.5ml,加入苯酚溶液0.5ml，加入浓硫酸2.5ml,摇匀，室温放置15min，30℃水浴放置15min,以0号管为空白, 于490 nm处测定吸收值，带入标准曲线中得出曲线对应糖含量,带入公式:糖含量=曲线对应的糖含量 (mg) ×稀释倍数/[当归溶液量 (ml) ×1 000]×100%。

三、实验结果

蛋白质含量测定

供试品 样品次数	1	2	3	平均值	蛋白质含量（mg/ml）
第一次洗涤蛋白质OD值	0.194	0.193	0.193	0.193	0.0194
第二次洗涤蛋白质OD值	0.180	0.180	0.180	0.180	0.0178
第三次洗涤蛋白质OD值	0.224	0.223	0.223	0.223	0.0231
沉淀蛋白质OD值	0.338	0.339	0.333	0.337	0.0372

多糖含量测定

供试品 样品次数	1	2	3	平均值	多糖含量（mg/ml)
第一次洗涤多糖OD值	1.372	1.371	1.371	1.371	0.1014
第二次洗涤多糖OD值	-0.378	-0.378	-0.378	-0.378	-0.03346
第三次洗涤多糖OD值	-0.319	-0.320	-0.321	-0.320	-0.02899
沉淀多糖OD值	0.956	0.955	0.952	0.954	0.06923

四、实验讨论

1、由蛋白质实验数据知，上清液、沉淀中均含有蛋白质。

2、由多糖实验数据知，上清液、沉淀中含糖量较大，而且保和口服液离心两次后，基本已洗涤掉可溶于水的多糖。

（二）沉淀的去除

一、实验目的

1、减少保和口服液沉淀量

2、测定经不同滤板过滤后保和口服液中有效成分橙皮苷的含量，来确定深层过滤纸板是否适用于保和口服液的过滤。

二、实验仪器与试剂

实验仪器：液相色谱仪（岛津2010）、超声仪（深圳市洁盟清洗设备有限，JP-060S）。

实验材料与试剂：注射器、微孔滤膜（0.22um）、1000μl移液枪、1ml移液管，2ml容量瓶2个，5ml容量瓶3个，进样瓶若干、scp-332、scp-334深层过滤纸板（沈阳长城过滤纸板有限公司）、橙皮苷标准品（乐美天医药德思特生物，纯度≥98%）、保和口服液（暂且保密）、甲醇（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）、蒸馏水、纯净水（天津海得润滋食品有限公司，GB17323）、磷酸（色谱纯85%，天津市大茂化学试剂厂），电子天平（奥豪斯仪器有限公司，EX225DZH），304不锈钢板框式过滤机（浙江海宁市红旗过滤设备有限公司，HQ-A）

三、实验方法

(1) 色谱条件

色谱柱（4.6*250mm）；流动相条件参照中国药典2005年版第一部附录IJ下保和口服液高效液相色谱法的流动相条件即甲醇：0.1%磷酸水=35:65；检测波长284nm；体积流量1ml/min；进样体积20ul。

(2) 橙皮苷标准品的配制

用万分之一的天平精密称取适量橙皮苷提取物于2ml容量瓶中，加入50％的甲醇定容至刻度线，超声10分钟混匀，超声结束后补液至刻度线，得2.5mg/ml的橙皮苷标准品的浓溶液。用100ul移液枪精密量取32ul橙皮苷标准品的浓溶液于2ml容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度线，超声10分钟混匀，超声结束后补液至刻度线后，得实验所需的40μg/ml的橙皮苷标准品。用注射器吸取适量40μg/ml橙皮苷标准品，用微孔滤膜过滤（前三滴液体弃去）于进样瓶中，待用。

（3）未过滤保和口服液样品的配制：

用1000ul移液枪精密移取1ml保和口服液于5ml容量瓶中，用50％甲醇定容至刻度线，于超声仪器超声10分钟使其充分混匀，超声后补液至刻度线。用注射器吸取适量混合液，用微孔滤膜过滤（前三滴液体弃去）于进样瓶中。

（4）经332滤板过滤的保和口服液样品的制备

将保和口服液经装有332滤板的板框压滤机过滤，即得。

（5）经334滤板过滤的保和口服液样品的制备

将保和口服液经装有334滤板的板框压滤机过滤，即得。

四、实验结果

1、精密度考察

随意取一瓶以上配置过的橙皮苷标准品溶液或者保和口服液样品溶液，重复进样6针，测定橙皮苷的峰面积，计算峰面积的RSD。

scp-332深层过滤纸板过滤样品的精密度考察

选取经过332长城滤板过滤过的保和口服液样品，进行精密度验证，结果如下：

名称	保留时间	平均保留时间	保留时间RSD	峰面积	平均峰面积	峰面积RSD
332 2-1	22.923	23.028	0.243786316	827832	866551	2.25
332 2-2	23.006			875524
332 2-3	23.054			882367
332 2-4	23.054			872616
332 2-5	23.059			872733
332 2-6	23.072			868233

结果：样品峰面积的RSD值为2.25，小于3，说明仪器的精密度良好。

scp-334深层过滤纸板样品的精密度考察

名称	保留时间	峰面积	平均峰面积	峰面积RSD
橙皮苷标准品	24.176	1998493
334-1	23.203	818037	806927	1.40
334-2	23.211	819549
334-3	23.175	813558
334-4	23.078	798170
334-5	23.002	795576
334-6	23.071	796674

结论：scp-334深层过滤纸板过滤样品的精密度考察，峰面积的RSD值为1.40，精密度考察合格。

2、重现性考察

取保和口服液样品，平行配制6个样品进样，测定橙皮苷的峰面积，计算RSD

未过滤样品的重现性考察

名称	保留时间	峰面积	平均峰面积	峰面积RSD
橙皮苷标准品	24.176	1998493
未过滤1	23.838	928249	916374	1.49
未过滤2	23.625	932329
未过滤3	23.583	921197
未过滤4	23.518	911996
未过滤5	23.379	909229
未过滤6	23.345	895243

结论：峰面积的RSD值为1.49，小于3，重现性考察合格。

3、样品含量的测定

各样品含量的测定

名称	保留时间		峰面积	平均峰面积	峰面积RSD	含量（ug/ml）
橙皮苷标准品	23.484	1931494				40
未过滤1	23.468	902989		904394	0.15	18.73
未过滤2	23.463	904430
未过滤3	23.439	905763
332 1	23.345	809195		807588	0.18	16.72
332 2	23.369	807097
332 3	23.422	806472
334 1	23.450	820461		818950	0.18	16.96
334 2	23.458	817549
334 3	23.461	818840

结果：未经滤板过滤的样品橙皮苷含量为18.73ug/ml

      经scp-332深层过滤纸板过滤的样品橙皮苷含量为16.72ug/ml

      经scp-334深层过滤纸板过滤的样品橙皮苷含量为16.96ug/ml

两次含量测定的RSD

名称	含量RSD
经332过滤样品	3.75
经334过滤样品	5.34
未过滤样品	1.90

结论：根据RSD值判断，两次含量测定结果无明显差异，说明此次含量测定可重复。

（三）保和口服液灭菌后稳定性实验

[size=14.0000pt]一、实验目的

[size=12.0000pt]1、为考察产品的稳定，我们通过观察灭菌和没灭菌保和口服液稳定性（是否有沉淀产生）

二、实验方法

[size=12.0000pt]1、试剂：保和口服液

[size=12.0000pt]2、仪器：YAMATO高压灭菌器、离心机

[size=12.0000pt]3、步骤：

[size=12.0000pt]（1）取4瓶保和口服液，将一瓶保和口服液均分于3个4ml离心管中，放入转速为4000r/min的离心机中离心20分钟，取出离心管，立即实现沉淀与上清液分离，将上清液混合，摇匀，重复四次，得上清液供试品。

[size=12.0000pt]（2）用注射器将上清液放入2ml安瓿瓶中，重复20次。

[size=12.0000pt]（3）将酒精喷灯点燃，熔封安瓿瓶，检查熔封好的安瓿瓶是否漏液。

[size=12.0000pt]（4）打开YAMATO高压灭菌器的电源，检查灭菌器正门里面冷却水瓶内部水是否需要补充（自来水即可，大约1500ml），打开高压灭菌器盖子，将10瓶熔封好的安瓿瓶放入接水盘中，让其浮在水面(在每次灭菌前需检查水位，水位不足需要补充加水)，关闭灭菌器盖子，设置温度105℃，时间30分钟。

[size=12.0000pt]（5）当灭菌器温度在60℃以下，打开盖子，取出安瓿瓶，关闭盖子，关掉电源。

[size=12.0000pt]（6）将安瓿瓶分成五份，每份四个，各两瓶灭菌过的安瓿瓶，两瓶没有灭菌过的安瓿瓶，将五份安瓿瓶分别放在-20℃、4-6℃、室温、40℃、60℃条件下观察，记录现象。

三、实验结果

①灭菌完成后即刻

样品 温度	-20℃	4-6℃	室温	40℃	60℃
没有灭菌安瓿瓶现象	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀
经过灭菌安瓿瓶现象	溶液颜色较深，无沉淀	溶液颜色较深，无沉淀	溶液颜色较深，无沉淀	溶液颜色较深，无沉淀	溶液颜色较深，无沉淀
现象	[size=9.0000pt]file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps1.png[size=9.0000pt] -20℃，均未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps2.png 4-6℃，均未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps3.png 室温，均未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps4.png 40℃，均未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps5.png 60℃，均未出现陈带你

②灭菌36h

样品 温度	-20℃	4-6℃	室温	40℃	60℃
没有灭菌安瓿瓶现象	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀
经过灭菌安瓿瓶现象	溶液颜色较深，无沉淀	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，无沉淀	溶液颜色较深，无沉淀	溶液颜色较深，无沉淀
现象	[size=9.0000pt]file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps6.png[size=9.0000pt] -20℃，无沉淀 [size=9.0000pt]	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps7.png 4-6℃，灭菌过的安瓿瓶出现沉淀，没有灭菌的安瓿瓶未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps8.png 室温，均未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps9.png 40℃，均未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps10.png 60℃，均未出现沉淀

③灭菌60h

样品 温度	-20℃	4-6℃	室温	40℃	60℃
没有灭菌安瓿瓶现象	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较浅，无沉淀
经过灭菌安瓿瓶现象	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，有沉淀
现象	[size=9.0000pt]file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps11.png[size=9.0000pt] -20℃，经过灭菌的溶液出现沉淀，没有灭菌的溶液未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps12.png 4-6℃，经过灭菌的溶液出现沉淀，没有灭菌的溶液未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps13.png 室温，经过灭菌的溶液出现沉淀，没有灭菌的溶液未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps14.png 40℃，经过灭菌的溶液出现沉淀，没有灭菌的溶液未出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps15.png 60℃，经过灭菌的溶液出现沉淀，没有灭菌的溶液未出现沉淀

④灭菌240h后

样品 温度	-20℃	4-6℃	室温	40℃	60℃
没有灭菌安瓿瓶现象	溶液颜色较浅，无沉淀	溶液颜色较深，有较少沉淀	溶液颜色较深，有较少沉淀	溶液颜色较深，有较少沉淀	溶液颜色较深，有较少沉淀
经过灭菌安瓿瓶现象	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，有沉淀	溶液颜色较深，有沉淀
现象[size=9.0000pt]。	[size=9.0000pt]file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps16.png[size=9.0000pt] -20℃，经过灭菌的溶液出现沉淀，没有灭菌的溶液出现沉淀	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps17.png 4-6℃，经过灭菌的溶液和没有灭菌的溶液人均出现沉淀，没有灭菌的溶液沉淀较少，而灭菌的溶液沉淀较多	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps18.png [size=9.0000pt] 室温，经过灭菌的溶液和没有灭菌的溶液人均出现沉淀，没有灭菌的溶液沉淀较少，而灭菌的溶液沉淀较多	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps19.png 40℃，经过灭菌的溶液和没有灭菌的溶液人均出现沉淀，没有灭菌的溶液沉淀较少，而灭菌的溶液沉淀较多	file:///C:\Users\NINGME~1\AppData\Local\Temp\ksohtml1440\wps20.png 60℃，经过灭菌的溶液和没有灭菌的溶液人均出现沉淀，没有灭菌的溶液沉淀较少，而灭菌的溶液沉淀较多

四、实验讨论

[size=12.0000pt]1、由实验结果可知，经过灭菌的安瓿瓶溶液颜色较没有灭菌的安瓿瓶的颜色深，

有可能是灭菌过的口服液较不稳定 。

2、有实验数据可知，放在4-6℃的灭菌过的口服液最先出现沉淀，可能是保和口服液在此温度不稳定。

附：研究过程中，我们对于过滤温度、PH值等影响以及不同过滤设备+耗材分别进行考擦，后续将会为大家分享。

灭菌实验中有五张图片由于上传后比较模糊，暂不上传，以文字方式体现，请各位老师多多指教！

沈阳长城过滤纸

是的，后续沉淀不排除口服液污染造成。

流云1234

对口服液的研究蛮有道理的

jhy711223

唯一不明白的一点就是-20℃条件下储存后沉淀怎么观察到的

沈阳长城过滤纸

jhy711223 发表于 2021-06-25 18:38
唯一不明白的一点就是-20℃条件下储存后沉淀怎么观察到的

取出后，溶剂瓶倒置观察，容器底部有少于黑色物质

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zrgjb

顺序18、完成最后浓缩。其实除了节能，浓缩本质上并没什么太大区别。

:-O夢醉西樓ゞ☆

口服液的话没有实验数据,但从生产经验来看,从醇沉时间,浓度,冷藏温度,时间来控制能有较好的沉淀表现,中药口服液灭菌后用常温晾干有较好的沉淀表现,晾干期间如果温度较高相当于做了加速,再加上中药本身如果一直不产生沉淀可能疗效会有的影响,一个中药研发的老教授是认同口服液有沉淀的,如果中药都参照西药的标准可能中药无法走出自己的道路,制定自己标准!没有必要什么都西化!

zrgjb

谢谢分享。