试验目的

观察“XXX”对体外培养的小鼠成纤维细胞（L-929）所产生的毒性反应，根据细胞相对增殖率（RGR）和细胞毒性评级标准（GB／T14233.2— 93医用输液 输血、注射器具检验方法．第二部分：生物试验方法）判定受试物的细胞毒性级别。

试验条件

1 细胞株和主要试剂

小鼠成纤维细胞株L-929，DMEM 细胞培养液，胎牛血清，台盼蓝，Hank’s缓冲液和PBS缓冲液，胰蛋白酶，硫酸链霉素，青霉素钠，DMSO。

2  仪器与设备

二氧化碳恒温细胞培养箱，超净工作台，倒置显微镜，高压消毒锅，一次性细胞培养瓶和96孔培养板，紫外分光光度仪。

受试物

XXX

剂量组别

高剂量组         100%受试物浸提液

低剂量组         50%受试物浸提液

阴性对照组       浸提溶剂（含10%胎牛血清的DMEM培养液）

阳性对照组       苯酚溶液（64g/L）

试验方法

1 细胞传代培养

DMEM培养液（含10%胎牛血清，100i.u/ml青霉素和硫酸链霉素，以下DMEM培养液如无特殊说明，均指此含胎牛血清和双抗的培养液）培养L-929 成纤维细胞至第三代，吸去培养液，Hank’s缓冲液洗涤3次，用0.25%胰蛋白酶将单层细胞消化成单细胞悬液，更换新鲜培养液后，取0.9ml该悬液与0.1ml 0.4％台盼蓝溶液混合，用血球计数仪在显微镜下计数后将细胞浓度调整到4×104／ml，接种于3个96孔细胞培养板（100μl／孔）。37℃培养24 h，使细胞贴壁生长。

2 细胞毒性试验

2.1 受试物用双蒸水超声波清洗10min，高温高压(15磅，121℃，15 min)消毒。将试样置于15 ml无菌离心管内，按培养液和试样表面积之比为10ml/cm2加入DMEM培养液，于37℃下浸渍24h。

2.2 将已在96孔板底长满的L-929细胞吸去原培养液，高剂量组每孔加入100μl原浓度（100％）浸提液，低剂量组每孔加入100μl 50％浸提液（等体积浸提液与DMEM培养液混和），阴性对照组仅加DMEM培养液（100μl/孔），阳性对照组加入以DMEM培养液溶解的苯酚溶液（64g/L，100μl/孔），每组设9孔，3块96孔板做相同处理。继续在 5％CO2、37℃培养箱内培养2d、4d、7d，每一时间段后取出1块培养板，加入0.5％MTT溶液（以PBS溶解）20μl／孔，继续培养5 h后，吸除孔内溶液并用PBS冲洗3遍，加入DMSO 100μl／孔以溶解细胞核内蓝色结晶，摇震10 min。 用分光光度计以490 nm波长测光密度值(optical density，OD)，DMSO为空白对照。按下式计算出细胞的相对增殖率(P％)：P％ = OD实验组/ OD阴性对照组×100%，按表1所示细胞相对增殖率（GRG）的均值评分标准评定该受试物的毒性程度。

表1细胞相对增殖率与细胞毒性级的对应关系

统计学分析处理 OD值以统计分析软件SPSS 10．0进行方差分析及t检验。

主要参考文献

1 GB／T16175—1996，医用有机硅材料生物评价试验方法

2 GB/T16886.5—2003，医疗器械生物学评价一第5部分：细胞毒性试验：体外法[s]．

3 赵克，程祥荣，高燕，等。Comfort义齿粘附剂的体外细胞毒性评价。华西口腔医学杂志，2004，22(2):162-164

4 傅远飞 陈德敏 张建中。MTT比色法评价掺锶羟磷灰石固溶体细胞毒性。生物医学工程学杂志，2001，18(3):289-390